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檢測線粒體膜電位的有機熒光探針(2)
來源: | 作者:泛肽生物研發中心團隊 | 發布時間: 2022-07-22 | 106 次瀏覽 | 分享到:

/單色熒光膜電位檢測探針


本文繼續就上一期線粒體膜電位(MMP)檢測的內容進行介紹。目前市面上已有的線粒體探針越來越豐富。針對不同類型的有機熒光探針的設計理念、響應機理和檢測方法,我們將其分為單色探針(monochromatic probes)、比例探針(ratiometric probes)和靶開關探針(target-switchable probes)。本文針對單色探針進行較為通俗的介紹。

單色熒光探針顧名思義就是一種識別顏色的探針。這種探針可以通過熒光強度的變化來監測MMP水平。根據熒光強度的變化情況(或淬火模式與非淬火模式的不同),探針又可分為開關探針(on-off probe)和關開探針(off-on probe)。

開-關熒光探針是經典的MMP檢測工具,具有聚集致猝滅(aggregation-caused quenching,ACQ)特性。在淬滅模式中,使用高負載濃度的探針對細胞進行染色,使其在線粒體中積聚足夠的濃度,形成聚集物,使熒光淬滅。因此,在高MMP水平時,探針集中在線粒體中,發出微弱的熒光。當MMP降低時,部分探針從線粒體釋放到細胞質中,線粒體中的熒光探針濃度降低,導致熒光強度增加。直至熒光強度達到最高,然后隨著MMP的丟失與熒光信號丟失而下降。因此,開-關熒光探針熒光強度與MMP成反相關,MMP越低,熒光值越高;MMP越高,熒光值越低。

相比之下,在非猝滅模式下,采用較低的加載濃度,探針在正常MMP水平顯示出較強的熒光信號。隨著MMP的減少,熒光強度下降。因此,關開探針的熒光強度與MMP的強弱是正相關的,即:熒光值越高,MMP越高;熒光值越低,MMP越低。

下圖便于理解這兩種類型的探針。

開-關熒光探針動態監測MMP的研究案例

2011年Harris等人使用Rhod 123染色大鼠初級皮質神經元。選擇Rhod 123的加載濃度為10μM,該濃度高到足以形成聚集體。孵育30分鐘后,清洗去除多余探針,37℃下靜置15分鐘,使Rhod 123熒光強度達到穩定狀態。然后在細胞中加入寡霉素(Oligomycin)增加MMP,由于聚集猝滅的ACQ作用,熒光強度下降。之后加入羰基-氰-對-三氟甲氧基苯腙(FCCP),降低MMP,熒光強度增加(見下圖)。

關-開熒光探針動態監測MMP的研究案例

Hiruta等人在2020年報道了一種近紅外熒光探針(KMG-501),同樣加入FCCP降低MMP,KMG-501熒光強度逐漸增加。

2015年,唐本忠教授團隊合成了一種新的線粒體熒光探針TPE-Ph-ln,它可以在MMP正常的線粒體中聚集,并發出強烈的紅色熒光。用寡霉素誘導MMP增高后,線粒體熒光強度增強;經過CCCP處理降低MMP,線粒體釋放TPE-Ph-ln,熒光信號減弱(見下圖)。

與此同時,蔣興宇教授團隊探索了TPE-indo檢測MMP的應用。在正常MMP水平下,它可在線粒體內聚集,并表現出較強的熒光信號。降低MMP后,探針從線粒體轉移到細胞質,TPE-indo熒光強度降低。

2016年,弗吉尼亞大學艾輝旺教授團隊(曾發明將綠色熒光蛋白探針紅移的技術)報道了一種可激活的近紅外熒光探針NIMAP,用于檢測活細胞中的MMP變化。當MMP水平較高時,NIMAP染色線粒體。分別加入寡霉素和FCCP增加和減少MMP,NIMAP的熒光強度分別對應的增加和減少。更重要的是,NIMAP在710nm的近紅外發射光也可以用來準確監測MMP變化。

隨著基礎研究、化學合成的技術進步,越來越多新的熒光探針被設計、合成,并應用。下一期我們將對更為特殊的線粒體探針(比例探針和靶開關探針)進行介紹。需要說明的是:上述線粒體探針均只能應用于科研;由于未取得醫療器械許可,目前還無法在臨床上使用。泛肽生物研發、生產的線粒體功能檢測試劑已獲得醫療器械二類注冊證,可應用于臨床,并能夠為臨床提供更好的檢驗服務。

附:部分線粒體探針信息匯總


    參考

?Pelletier-Galarneau M, et al. Quantification of Myocardial Mitochondrial Membrane Potential Using PET. Curr Cardiol Rep. 2021, 10, 23(6): 70. doi: 10.1007/s11886-021-01500-8.

?Leung CW, et al. A photostable AIE luminogen for specific mitochondrial imaging and tracking. J Am Chem Soc. 2013 Jan 9;135(1):62-5. doi: 10.1021/ja310324q. Epub 2012 Dec 20.

?Murata O, et al. Near-Infrared Fluorescent Probes for Imaging of Intracellular Mg2+ and Application to Multi-Color Imaging of Mg2+, ATP, and Mitochondrial Membrane Potential. Anal Chem . 2020 Jan 7;92(1):966-974. doi: 10.1021/acs.analchem.9b03872. Epub 2019 Nov 27.

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